Roneo 3 p6

[gaelle.mi]

Salut, apres avoir amplifier l'adn par PCR en emulsion on fait une etape de sequencage
Donc apres notre PCR on retrouve un melange d'ADN fixé autour des spheres ayant l'extremité 3' des primers biotinylés et non 5' comme dans la roneo p6 ?
Merci ☺️

[LAMsa]

Yo je m'incruste !

Si on peux avoir un gros résumer de cette partie ce serait méga génial ! Je ne comprends pas trop pourquoi l'ADN ne s'attache pas directement aux sphères, donc avec une petite explication ça irait mieux ^^

Merci d'avance !

[gaelle.mi]

Je crois que ca serait vraiment une tres bonne idee !!
☺️☺️

[rurumime]

+111

[gaelle.mi]

☺️

[Sow~]

Coucou!

Alors, on vous a pas oublié
Juste, on attend la réponse de la Prof avant, pour être sure de ne pas vous dire de bêtises sur cette partie! ^^
Dès qu'elle nous répond, on vous fait le Récap! Je mets le post en attente!

Bonne journée!

[A!ex]

+1

[Chewbacca]

+1

[Spooky]

Oué ca serait cool merci!

[Sow~]

Hello!


Alors, pour une explication plus complète de la PCR en émulsion, j'avais fait un récap dans ce post : viewtopic.php?f=717&t=80584

Bon, ici, on reprend juste à la fin de la PCR en émulsion :

Vous voyez que le fragment de départ (encadré en rouge) et le fragment d'ADN biotinylé obtenu (encadré en bleu) ne sont pas totalement identiques : il y a eu ajout d'une petite séquence supplémentaire (en rose), complémentaire de la séquence du primer de la sphère.

Donc, vous comprenez bien que l’hybridation avec le primer situé sur la sphère ne peut se faire qu’avec le dernier brin nouvellement synthétisé, et pas avant, c'est pourquoi on a besoin des premières étapes et que l'amplification ne débute pas directement sur la sphère. (Je crois que ça répond à ta question LAMsa ^^)

Donc, après, une fois le fragment biotinylé hybridé sur la sphère, l'ADN polymérase va synthétiser le brin complémentaire à partir du primer de la sphère, et on aura de l'ADN double brin fixé à la sphère avec une extrémité 5' biotinylée (confirmé par la Prof), comme représenté ci-dessous :

Au bout de n cycles, on se retrouvera avec une sphère recouverte de fragments PCR amplifiés, avec à chaque fois l'extrémité 5' biotinylées.

Ensuite, vient l'étape de purification des sphères avec ADN amplifié grâce à l'hybridation biotine/streptavidine et l'utilisation d'un aimant.
A ce niveau-là, notre ADN d'intérêt est encore sous forme double brin et possède une biotine en 5'.

Puis, juste avant le séquençage, on va dénaturer notre ADN double brin à 95°C afin de libérer les brins biotinylés en 5', car le brin qu'on va ensuite séquencer c'est le brin non biotinylé : (étape non décrite en cours)

Vous remarquez donc que la sphère qui va partir au séquençage n'est pas biotinylée (sur le schéma à la diapo 18, il faut enlever la biotine aux extrémités des brins pour que ça soit juste, confirmé par la Prof).

Donc, une fois l'étape de dénaturation finie, pour débuter le séquençage, on va hybrider une amorce à l'extrémité 3' du brin fixé à la sphère. Cette amorce est complémentaire du primer A (en rouge) du fragment d'intérêt : (schéma rectifié par rapport à celui de la diapo 18)

Cette dernière étape de dénaturation/hybridation (non détaillée en Cours parce que la Prof voulait vous simplifier exprès le truc ^^) se fait juste avant de charger les sphères sur la puce.


Donc, si on résume l'histoire de la biotine, on a :
A la fin de la PCR en émulsion = Extrémités 5’ biotinylées
Lors de la purification avec l’aimant = Extrémités 5' biotinylées
Au moment du séquençage = ADN simple brin sans biotine (perte suite à la dénaturation)


Est-ce que c'est mieux?

[Chewbacca]

Génial merci

[LAMsa]

Merciiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii Sow~ !!