Méthode Sanger

[Chewbacca]

bonjour, j'ai vu les précédents post mais je ne suis pas trop d'accord sur un point
Dans la ronéo on dit que la méthode de Sanger utilise des dDNTP radiomarqué
Mais en lisant la diapo du prof je trouve pas ça logique car sinon il n'y aucun intérêt de prendre 4 tubes séparés

Je m'explique, voilà comme je comprends les choses:
-Dans la méthode Sanger on a 4 dDNTP non marqués qui se répartissent chacun dans un tube à essai
--->donc pour reconnaître quel dDNTP a été intégré on va regarder de quel tube à essai il s'agit
-Dans la méthode automatisée on a les dDNTP qui sont marqués par un fluorochrome et tous dans le même tube
--->donc pour les reconnaître alorsqu'ils sont tous mélangés on utilise les propriétés fluorescentes
Donc au final la prof dans son diapo ne parle que des dDNTP marqués dans le séquençage automatisé et ça me semble plutôt logique..

Merci d'avance pitié dites moi que c'est juste sinon je suis perdu ^^

[Sow~]

Salut!


Alors, ton résumé est correct, tu as compris le principe, mais il y a juste un petit point qui ne va pas : le radiomarquage et l'utilisation des fluorochromes sont 2 choses différentes.

Le marquage des acides nucléiques permet de visualiser les fragments d'ADN lors de l'électrophorèse par exemple.
Il existe 2 méthodes pour marquer les acides nucléiques :
Utilisation d'agent intercalant comme le bromure d'éthidium qui émet une fluorescence rose sous une lumière UV (cf Cours 1)
Utilisation de ddNTP radioactifs (= radiomarqués)

Le radiomarquage sert donc juste à repérer et détecter nos fragments à la fin. Il ne permet pas de faire la différence entre tel ou tel ddNTP, contrairement aux fluorochromes (où on a une couleur pour chaque ddNTP).
C'est pourquoi dans la méthode de Sanger, on réalise 4 réactions indépendantes, avec 4 tubes différents. Et il y a bien des ddNTP radiomarqués. ^^


J'ai trouvé ce récap qui résume bien tout ça :

Méthode Sanger :
- Utilisation de ddNTP radiomarqués
- 4 réactions indépendantes séparées pour ne permettre l'incorporation que d'un seul type de ddNTP par tube, donc 4 tubes différents
- Ajout sur un gel pour migration élécrophorétique de chacun des tubes pour avoir une lecture de la séquence en commencent par le bas du gel afin de commencer par le plus petit fragment

Méthode actuelle : (inspiré du principe de la méthode Sanger)
- Utilisation de ddNTP couplés à un fluorochrome
- 4 réactions dans un même tube donc mélange de 4 types de ddNTP dans un même tube
- Migration éléctrophorétique du contenu du tube

Séquenceur automatique :
Même principe que la méthode actuelle sauf que l'on fait passer les brins d'ADN dans un système de migration par capillaire avec une lecture laser à la fin.

C'est plus clair?

[Chewbacca]

Ah d'accord oui en effet j'avais pas du tout fais la différence
merci beaucoup parfait