Mrs.zweig a écrit:Bonjour,
Alors on dit qu'il est plus avantageux d'utiliser l'immunofluorescence indirecte que la directe parce que cela "amplifie le signal " J'aimerai savoir pourquoi, comment, par quel(s) phénomène(s) ? en effet, je ne comprend pas bien en quoi le fait que le fluorochrome soit sur l'anticorps secondaire ou le primaire peut changer l'ampleur du signal
Sur cette image tu vois bien l’amplification du signal en immunofluorescence indirecte.
Pour la directe : 1 seul Ac se fixe a la molécule cible et il porte la fluorescence
Pour l’indirecte : 1 seul Ac se fixe à la mol cible (Ac primaire) MAIS plusieurs Ac (Ac secondaires) se fixent sur le premier Ac ; et comme ces Ac secondaires portent la fluorescence on va avoir un bien meilleur signal car beaucoup + de mol fluorescentes sont accrochées à la mol cible.
De plus, pourrais-je avoir un petit topo Dapi/Hoechst VS la méthode fish s'il vous plait ? Car étant donné que les deux traitent de l'ADN je m'embrouille un peu !!
Ah oui aussi concernant DAPI on dit que l'euchromatine peu condensée est faiblement marquée pourquoi ?
En effet les deux techniques fonctionnent sur l'ADN:
--> Le FISH sert a tracer un gène particulier dans le noyau, à savoir son emplacement dans le génome. On va attacher une
sonde fluorescente Spécifique à un morceau d'ADN. Ca va par exemple permettre de faire des cartes génétiques càd qu'on va pouvoir déterminer l'ordre des gènes dans un chromosome.
-->
L'Hoechst et le DAPI ne sont pas spécifique à une portion d'ADN particulière c'est LA différence avec le FISH. Ils vont marquer tout l'ADN. Du coup la quantité de colorants dans une zone du noyau dépend de la concentration d'ADN dans cette zone, c'est proportionnel --> ça va servir a visualiser l'euchromatine et l'hétérochromatine.
L'euchromatine c'est de L'ADN peu condensé dans le noyau donc il y aura également une petite concentration de DAPI et une fluorescence faible.
L'hétérochromatine c'est l'ADN très condensé donc il y aura beaucoup de DAPI donc une fluorescence plus forte.
Et on peut considérer que dapi et Hoescht appartiennent aussi à la catégorie des marqueurs de l'ADN qui ne sont pas naturellement fluorescent c'est ça ?
Oui c'est ça ! La fluorescence est intrinsèque à la GFP càd que c'est indépendant des facteurs extérieurs, elle exprime sa fluorescence quoiqu'il arrive. La fluorescence de l'Hoescht/dapi n'est pas intrinsèque au colorant : si le colorant n'entre jamais en réaction avec sa cible (en l'occurence l'ADN) il n'exprime aucune fluorescence; ça va dépendre du milieu.
Et qu'apporte le fait qu'en plus d'etre des marqueurs fluorescents ils soient des colorants ? De la couleur fluorescente tout simplement ?
Ici c'est plus un abus de langage qu'autre chose ^^
Ce ne sont pas des colorants au sens propre tels qu'on les connait en microscopie optique conventionnelle mais il vont quand même colorer l'ADN de leur fluorescence. Dans son cours le prof se sert simplement du mot "colorant" pour différencier l'Hoescht/dapi (se fixent sur les bases AT uniquement) des intercalants qui sont aussi des colorants d'ADN mais se fixant sur toutes les bases ATGC.
En gros on peut appeler "colorant" l'Hoechts le dapi les intercalants et d'autres molécules... c'est une généralité.
Même si c'est toujours flou, je te rassure le prof ne demandera jamais quelque chose d'aussi ambigue le jour du concours
Enfin, quand on parle d'agent intercalant on sous entend que lorsqu'on a deux bases appariées A-T l'agent se met entre ces dernières ou on a deux bases appariés, l'agent intercalant qui se crée un espace et vient ensuite une autre paire de bases associées ? De plus quand on parle du bromure d'éthidium et de l'iodure de propidium on dit que ce sont des agents intercalants mais sont ils specifiques ? sinon quel est leur intérêt etant donné qu'existent dapi et hoescht ?
L'agent intercalant s'insère entre 2 nucléotides côte à côte dans 1 brin d'ADN.
L'iodure de propidium et le bromure d'éthidium sont des intercalants donc : ils sont spécifiques à leur cible (l'ADN) mais ils ne sont pas spécifiques à certains nucléotides dans l'ADN
L'Hoechst et le dapi sont spécifiques a l'ADN également et sont aussi spécifiques à certains nucléotides dans l'ADN. (A et T)
Certaines de leurs caractéristiques sont un peu différentes (ex : la capacité à traverser la mb de la cellule ou la solubilité...) mais sinon les intercalants ne sont pas mieux ou moins bien que le dapi ou l'Hoechst, on utilise simplement l'un ou l'autre pour réaliser la même technique dans des contextes différents.
Cette dernière réponse c'est + de la cluture que du cours, le prof ne va pas si loin dans ses explications
J'espère que j'ai pu t'aider
Merci d'avance pour votre réponse 
