Hey !
Alors je t'avoue que je ne comprends pas trop ton exemple avec les "X"
Il faut déjà que tu retiennes qu'on utilise les enzymes Bfm I et Hpa II
séparément: on utilise d'un côté uniquement Hpa II pour digérer nos produits PCR et on fait une première migration électrophorétique.
Puis, dans un second temps, on prend d'autres produits PCR (tu vois déjà l'intérêt de faire une PCR après extraction du matériel génétique du patient, on peut faire plusieurs manipulations différentes et séparément
) et cette fois-ci on utilise l'autre enzyme, Bfm I pour le coup ! Ensuite de la même façon, on fait migrer les produits de digestion sur gel.
On utilise les deux enzymes séparément puisqu'elles détectent
deux mutations différentes du même nucléotide, on ne peut donc pour chaque patient avoir
qu'une seule des deux mutations ! Donc si BfmI coupe, HpaII ne coupera pas puisqu’on ne peut avoir qu’une seule des deux mutations : si l’individu est homozygote, il possèdera obligatoirement la même mutation sur ses deux allèles (tu ne peux pas avoir un allèle muté c.1138G>A reconnu par BfmI, et l'autre allèle muté c.1138G>C reconnu par HpaII c'est impossible, l'homozygote aura soit deux allèles mutés c.1138G>A, soit deux allèles mutés c.1138G>C)
S’il n’y a aucune mutation et que la séquence est saine, alors aucune enzyme ne coupera !
Une fois qu'on a fait nos deux PCR-RFLP, c'est-à-dire nos deux migrations sur gel on regarde la taille des fragments après coupure.
Je vais maintenant te prendre un exemple de raisonnement qu'il faut avoir pour les expériences avec
l'enzyme Bfm I (c'est exactement pareil avec Hpa II c'est juste la nature de la mutation qui change). On distingue trois cas de figure quand on interprète l'électrophorèse :
1) Si le patient est
homozygote pour la mutation c.1138G>A (je te rappelle qu'on utilise Bfm I qui reconnaît
spécifiquement cette mutation) on aura uniquement
deux fragments d’ADN à 109 et 55 pb (le produit d'amplification PCR dans le cas de l'achondroplasie faisant d'après le cours en règle générale 109 + 55 = 164 pb, je te mets les valeurs de référence pour que tu comprennes l'exemple mais elles peuvent changer d'un QCM à l'autre c'est normal c'est fait exprès mais le raisonnement à avoir reste le même).
L’enzyme de restriction Bfm I a coupé les deux allèles mutés du gène (BfmI a coupé deux fois et on a donc deux fragments à 109 pb et deux fragments à 55 pb qui se superposent) on ne voit donc sur l'électrophorèse que deux fragments alors qu'il y en a en réalité quatre superposés deux à deux car les deux allèles ont étés coupés au même endroit et ont donc généré des fragments de même taille !
Je te rappelle qu'un individu homozygote possède forcément la même mutation sur ses deux allèles.
2) Si le patient est hétérozygote pour la mutation c.1138G>A on aura trois fragments d’ADN sur la piste du gel.
En effet un seul des deux allèles a été digéré car l’autre est sain : l’enzyme n’a donc pas reconnu sa séquence et n’a pas pu couper !
On aura donc un allèle digéré qui génère comme dans le cas précédent deux fragments à 109 et 55 pb, et un autre allèle sain non digéré qui reste à un total de 164 pb !
3) Si le patient possède l'autre mutation possible c.1138G>C reconnue par HpaII, BfmI ne coupera pas car elle ne reconnaît que la mutation c.1138G>A !
On aura donc le même cas de figure que si le patient était sain ce qui n’est pas le cas, on a juste pas utilisé la bonne enzyme !
Si une enzyme ne digère pas l’allèle du patient il faudra toujours essayer avec l’autre enzyme avant de conclure à une absence de mutation !
Le patient est sain uniquement si aucune des deux enzymes ne peut digérer les fragments ! On doit donc avoir deux électrophorèses (une pour Bfm I et une pour Hpa II) avec des fragments sains migrant uniquement à 164 pb pour reprendre mon exemple (c'est-à-dire le poids total du produit d'amplification quand il n'est pas coupé par une enzyme).
Est-ce que c'est clair ? (cette explication est reprise avec des schémas dans la fiche de cours *
complète* qui sortira en début de semaine prochaine)
