ChlP

[BatBouut]

bonjour

Concernant le ChIP, dans la 5eme étape c'est à dire " l'estimation de l'enrichissement relatif d'une séquence donnée ( la chromatine c'est ça ? ) dans l'immunoprécipité par rapport à :

- une séquence contrôle. ( c'est a dire l'ADN nu ? sinon c par rapport à quel séquences ? )
- à l'ADN de départ "avant l'immunoprécipitation". (c'est quoi la différence entre les deux ? )

je comprend pas trop les étapes du ChIP et je pense que c'est important de comprendre

merci d'avaance

[strawhat]

Coucou!

On va reprendre calmement les étapes du CHIP (Chromatin Immuno-Precipitation), et tu me dis là où c'est pas clair

Tout d'abord, comme tu le sais, il s'agit d'une technique étudiant les modifications de la queue N-term des histones, on étudie plus généralement le code histone. Il y a plusieurs étapes :

1) Pontage.
Etape réversible, qui consiste à ''ponter'' ou ''cross-linker'', les liaisons ADN-Protéines dans la cellule, à l'aides d'agents chimiques (formaldéhyde) on va tout simplement figer ces liaisons.

2) Sonication.
C'est une fragmentation de la chromatine, on va la couper en morceaux via des ultrasons. Chaque modification (donc chaque histone qui va être modifiée) sera associée à une couleur grâce à des Ac qui s'y fixeront spécifiquement, on va donc avoir à notre disposition toutes les modifications post-traductionelles de la séquence étudiée, tu me suis ?

3) Purification.
On va cette fois purifier les complexes immuns (Ac+partie de l'ADN qui nous intéresse) pour faire en sorte de ne garder QUE l'ADN double brin, on enlève ainsi les protéines.

Maintenant on va adopter une démarche différente, qui va être celle de voir le ''degré'' de modification présent dans la séquence étudiée (immunoprécipitat), par rapport à une séquence de référence (input), on va faire une PCR quantitative (revu au S2 en UE11)

Il faut surtout garder en tête le but de l'expérience qui est de repérer les modifications post-trad des histones, dans cette dernière partie de l'expérience, on va quantifier l'enrichissement post-trad qu'on ne trouverait pas en temps normal, c'est-à-dire qu'on va faire un ratio pour voir ce que représente notre modification ciblée par rapport au génome, ça donne une info quantitative... bueno ?

Ainsi, tu l'auras compris, si qté de fragments d'ADN dans l'immunoprécipitat (RIP) > qté ADN dans l'input (RC), on a un enrichissement de la modification étudiée qui est responsable d'une plus grande expression du gène en question.


Petite parenthèse, essaie de comprendre les grandes lignes de l'expérience, les formules mathématiques et les détails sont inutiles et ne tomberont jamais au concours J'espère que c'est tout bon, sinon n'hésite pas

[BatBouut]

1) le pontage : quand on parle de protéines, on parle des histone c'est ça ? donc en gros en fixe bien les histone a l'adn ?
2) A) en fin de sonication : on obtient des nucléosomes séparés possédant différentes combinaisons de modifications poste traductionnelle + adn linker fragmenté, c'est ça ?
B) on fait l'immunoprécipitation avec des anticorps associé chacun à une modification donné des histones , et à une couleur donné, c'est ça ?
3) LA je NE comprend PAS :
"On va cette fois purifier les complexes immuns (Ac+partie de l'ADN qui nous intéresse) pour faire en sorte de ne garder QUE l'ADN double brin, on enlève ainsi les protéines"
A) du coup la, en gros on va enlevé, précipité, purifier les (anticorps avec les modifications des histones)=(complexe immuns)
B) réversion du pontage: pour retrouver l'adn nu

du coup la on a enfin : les complexe immun issu de l'immunoprécipitation du nucléosomes + adn nu qui était lié au tt début au nucléosome
et on pourra donc calculer RIP

c'est ça ?

et on pourra donc la comparer à la Rc , PAR CONTRE LA JE NE COMPREND RIEN, tout ce qui est PCR et tt :'(

et est ce que le PCR il est aussi utiliser pour calculer RIP ?

merci d'avaance

[strawhat]

Daccc on va y aller point par point, mais encore une fois y'a des choses plus importantes, et ça dépasse donc l'objet du cours de Gilson...

1) Quand on parle du pontage on parle bien-sûr des histones ou protéines histones mais aussi des facteurs de transcriptions (mais ça osef c'est HP), et effectivement on fixe, on forme des ''ponts'' entre l'ADN et les histones.

2) A) Alors là tout simplement tu vas avoir L'ADN génomique (donc par extension les nucléosomes et l'ADN linker), maintenant ponté avec une grande quantité de protéines, qui va être brisé pour donner des fragments de petite tailles.
B) Pour récupérer les fragments d'ADN sur lesquels se trouve pontée l'histone qui nous intéresse, on utilise un anticorps qui est spécifique de par sa couleur donc, contre cette dernière

3) ABCDEFG
Yes jackpot, dans ma première réponse je t'ai mis que le résultat final (lequel tu dois idéalement retenir pour le cc, même si y'a peu de chances que ça tombe tel quel) pour simplifier, mais en réalité tu as toutes étapes que tu viens de lister

Je rajouterai juste que la réversion (sous étape comprise dans la purification) se fait par la chaleur, ainsi on va libérer des fragments d'ADN qui seront en faible quantité, or nous pour analyser tout ça on doit en avoir en quantité suffisante, qu'est-ce qui va nous permettre d'amplifier tout ça ?
LA PCR , voilà retiens juste qu'elle va amplifier le tout, tu t'y pencheras suffisamment au S2

La PCR sera donc utilisée pour estimer l'enrichissement de la séquence par rapport à la référence!

Gigi n'est pas bien méchant, si tu vois le but de l'expérience c'est parfait, bon courage!