séquençage Wolfram PCR mélangés

[Champ's]

Coucou ! Ma question est toute bête en fait mais j'ai beaucoup de mal à comprendre pourquoi l'allèle paternel et maternel sont mélangés dans le PCR (et donc qu'il faut faire un clonage moléculaire). Est il possible de m'expliquer ? Merci beaucoup !!

[AnNévrisme]

Coucou,

On a besoin du clonage moléculaire car si tu prends une cellule d'un patient son génome contient deux allèles pour un même : un reçu par le chromosome du père et un maternelle
Donc dans son cytoplasme la production de protéines se fera à partir des deux allèles : ici on aura donc de la Wolframine issu du gène paternel et de la Wolframine issue de l'allèle paternel qui flottent ensemble das le cytoplasme.
Quand on fait l'extraction des ARNm on les extraient tous et quand on fait la PCR et le séquençage, même si les allèles sont un peu différent ils auront tous les deux les mêmes bornes d'amont et d'aval caractéristiques du gène auxquels vont correspondre nos amorces.

Résultats : on se retrouve avec le Séquençage des deux allèles en même temps mais comme ici celui de la mère donne un ARNm plus long les séquence de chevauche au décalage c'est interprétable on arrive plus à lire la suite de nucléotides (en Sanger ou en Séquencage automatique)

(Moi aussi j'ai eu du mal à comprendre cette notion ahah t'inquiète)

C'est plus clair pour toi ?

Bonne soirée et bon courage pour ce S2

[Champ's]

Oui merci beaucoup pour cette explication j'ai tout compris ! merci beaucoup !

[BloodyMary]

Coucou !

j'ai pas compris en fait ce qui était mélangé, quand dans la ronéo on dit "on a 2 variants" on parle de quoi exactement ? l'allèle muté de la mère et l'allèle normal de la mère ? ou la PCR du père et la PCR de la mère ? car après on dit qu'il faut "séparer les 2 PCR"

Merci

[AnNévrisme]

Coucou,

En fait à la base on recueille tous les ARNm de l'enfant se trouvant dans son cytoplasme et codant pour la Wolframine.


Pour rappel, ces ARNm sont produits, dans le noyau de l'enfant, à partir des deux allèles (=version du gène) qu'il possède pour le gène (un sur chaque chromosome). Il a donc hérité d'un allèle du père (du chromosome paternel) et un de la mère.

Ensuite on fera la PCR de l'ARNm Wolframine (sans différencier père et mère, tout ce qui est ARNm Wolframine on prend et on amplifie, grâce au amorces de la PCR).
On obtient alors 2^n (avec n le nombre de cycle) allèle maternel et 2^n paternel.

Pour l'instant tout paraît rouler.

Ce n'est qu'après, en sequencant qu'on se rend compte que c'est illisible (à cause du décalage de L'ARNm maternel plus long) et donc qu'on doit séparer les deux allèles pour séquencer individuellement l'allèle mère et l'allèle père comme s'ils étaient seuls chacun dans une cellule.

On va en fait devoir séparer ces deux produits de PCR c'est à dire isoler les produits PCR (=ARNm multipliés grâce à la PCR) maternel et les produits PCR paternel.

D'où la formulation "on sépare les deux PCR".

C'est mieux pour toi ?

[BloodyMary]

D'accord c'est beaucoup plus clair merci !