Exons

[Verveine]

Re salut !
Je me pose aussi une question un peu technique qui est de savoir comment on fait pour isoler que nos bouts d exons pour faire notamment les 7 PCR dans le cas du syndrome de Wolfram .

Tu aurais une explication par hasard ?

Merci beaucoup !!

[Verveine]

Pcq enfaite je me dis que comme la PCR de premier abord se fait sur les exons et qu'en partant de l ARNm transformé en ADNc on a que les exons , ça me parait plus facile que de partir de l ADN et tt ces trucs superflus.
Surtout que je vois pas comment on sélectionne juste les exons quand on a tt le ADN pour faire la PCR

[AnNévrisme]

Coucou ! Alors la prof l'explique dans le cours en tout cas l'année dernière, j'ai remis les explications sur ma fiche du cours 2 (je dis ça si tu veux reprendre toute la démarche sur Wolfram).

Alors, on va faire 7 amplifications par PCR des 7 exons codant (pas le 1 du coup dans ce cas là pour Wolfram) et de leurs jonctions avec les introns. On place nos primers de part et d'autre des exons. On séquence à chaque fois l’exon en question et les 5 premiers/derniers nucléotides des introns : ce sont des sites d’épissage.

Pour ta deuxième question je te join directement l'illustration des PCR réalisés à partir d'un ADNc tombé au concours en 2017.

C'est bon pour toi ?

[Verveine]

D'accord suepr !

Mais du coup j'ai toujours pas compris pq ce ne serait pas plus simple de toujours partir des ARNm transformés en ADNc ( qui aurint tt ce qui sera traduit ) plutôt que de partir de l ADN en isolant les exons avec des primers.

[AnNévrisme]

La prof paraît donner trois raisons dans le cours :

1. Rappelle toi que les ARNm sont certes plus représentatifs de ce qui va être produit comme protéine, mais ils sont aussi plus sensible aux RNases donc leur extraction est plus complexe et ne se fait pas en routine (++ retient bien ça)

On s'en ai servi pour l'exemple de Wolfram dans le cour parceque le séquençage de L'ADN n'était pas concluant car ici la mutation était dans une séquence intronique, ça m'amène à la 2ème raison

2. La prof précise que même si le génome humain à été séquencé : on en connaît pas tout l'exome: on ne sait pas le rôle de chaque gène (=qu'elles protéines ils vont produires ou autre) et on connaît encore moins les introns ! Ce sont des séquences donc les mutations sont très peu prévisible donc on ne peut pas les cartographier pour avoir une référence si on repère une région intronique mutée -> c'est pour ça qu'en routine (= la majorité du temps de la labo de Biomol) ils sequencent que l'exome (les différents exons qui les intéressent en utilisant les amorces adéquates) et la plupart du temps ils trouvent une mutation dans l'exome.

Puis :
-si la mutation est connue (=d'autres chercheurs l'ont déjà rencontré sur d'autres patients et ont prouvés la pathogénicité de la mutation) exemple de l'achondroplasie -> ils posent le diagnostic

-s'ils savent pas, ils font un vecteur d'expression pour voir en quoi la mutation impacte la protéine.

3. Ça te fais faire une étape en plus (transcriptase inverse en plus) et donc ça demande plus de temps, d'argent, de risque qu'entre chaque manips s'il y'a une erreur etc...

Retiens qu'au final on prélève le patient -> on extrait l'ADN -> et hop on fait nos PCR en ciblant ce que l'on veut grâce au choix des amorces sens et antisens (sur le schémas ça représente l'extrémité des flèches)

C'est mieux pour toi ?

[Verveine]

Oui c'est parfait, je te remercie !!