dégradation NGS

[lympho6mon B]

Salut,
Je ne comprends pas trop, dans la NGS, on fixe des barres-codes avant de mettre les billes pour sélectionner que l'ADN qu'on veut et après on dégrade ces captures.
Ces captures elles reconnaissent spécifiquement l'ADN qu'on veut codé sur un fragment, mais une fois qu'on la dégrade, on a encore le fragment entier non ? (pour avoir encore les barre-codes) Donc on a isolé des fragments contenant l'ADN qu'on veut mais aussi plein d'autres ADN ?
C'est pour savoir si j'ai bien compris ?

[lympho6mon B]

?

[AnNévrisme]

Salut,

Je suis désolée mais je suis pas sûre d'avoir bien compris ta question
Je vais faire un récap et tu me diras si c'est ce que tu pensais aussi :
On a notre matériel génétique extrait des cellules (pas GR) répliqué (cas A c'est celui décrit par la prof) ou notre matériel issu de PCR (cas B)

1ere étape : on utilise des endonucleases pour couper le matériel génétique en brins d'environ 200/400pb
Parmis ces bouts on a des bouts de gènes dont on s'en fiche (cas A).

2eme étape: on ajoute à TOUS CES BOUTS les adaptateurs + barres codes

3 ème étape: on utilise des sondes d'ARNm complémentaire des séquences du gène qu'on cherche (et qui sont caractéristiques du gène cherché, dans la génome humain)
Ces sondes sont biotinylée

4eme étape : on se sert des billes magnétique avec streptavidine pour que la streptavidine s'accroche au sonde biotinylée et donc aux bouts de matériel génétique qui nous intéresse !!
Ensuite, grâce à l'aimantation on récupère les billes accroché au sonde elle même sur le matériel qui nous intéresse.

Résultats : on a bien isolé tous les différents fragments du gène qui nous intéresse

Est ce qu'il y'a une étape pas clair ? N'hésite pas si j'ai pas répondu à ta question

[lympho6mon B]

Alors tout est clair, et du coup c'est ce que je pensais, j'avais bien compris, et du coup ce que je voulais dire, c'est quand on isole grâce à la liaison biotine/streptavidine les fragments qui nous intéressent, dans ces fragments de 200/400 pb, on a des "bout de fragments" qui ne nous intéresse pas, c'est bien ça ? et autre chose, du coup, comme on coupe aléatoirement, on peut couper nos gênes d'intéret ?
parce que c'est ça en fait je me demande, imagine dans les fragments d'intérets isolés, la séquence reconnue est entre 10pb et 30pb et que après 80pb on a un autre gêne,mais que le gêne fait 300pb, on aura qu'une toute partie du gêne avec un grand bout de gêne qui nous intéresse pas....

[AnNévrisme]

Attention, grâce à la capture par sonde ARN les bouts après lavage des billes magnétique on se retrouve "forcément" avec des bouts avec des séquences qui nous intéressent.

Comme tu dis dans un fragment de 200pb capturé par sonde ARN il peut y avoir seulement 100pb concernant notre gène mais on séquencera ce bout et c'est à l'étape du réalignement informatique de chaque bout sur une séquence type du gène qu'on obtiendra le séquençage final

[lympho6mon B]

Mais il y a forcément des gènes avec des bouts qui se ressemblent, il y a tellement de gènes que je me demande comment fait-on d'ailleurs pour les repérer avec des si petites séquences alors qu'on a que 4dntp différents ?
Et imagine on a un gène coupé en 2, lors de la fragmentation aléatoire, comment on fait pour le retrouver ? et si notre séquence qu'on reconnait n'est pas coupée, on aura que une petite partie du gène et le reste ne sera pas garder...

[AnNévrisme]

Salut

Alors je comprends que tu puisses te poser ces questions, perso j'avais établi ce raisonnement que je te met en schéma

• Les 3 brins double brin correspondent tout les 3 au même gène et ce sont les 3 types de coupures (parmis une infinité on est d'accord) que je détailles.

• Les deux sondes de captures qui reconnaîtront ce gène sont représentées par les traits fluo et vert clair.

On voit 2 sondes aussi dans les schémas de la prof

Pour ce qui est de ta première question :
L'annee dernière la prof avait expliqué que le génome à été séquence entièrement (même si on est très très loin de connaître tous les gènes ni leur rôles!!) Et qu'à partir de là on a pu détecter des bouts des gènes qui sont caractéristiques de ceux-ci !
Rappelles toi que sur une succession de par exemple 20 nucléotides on a 4 nucléotides possibles à chaque fois ça fait un paquet de combinaisons possibles... ! Donc retiens juste que les sondes ARN sont complémentaires de régions spécifique au gène d'intérêt (c'ets texto du cours)

C'est plus clair pour toi ?

[lympho6mon B]

Alors non c'est toujours pas clair mdrr mais bon je vais apprendre ce qu'on a à apprendre et tampis.
Merci quand même