par Kick-Ass » 17 Sep 2013, 21:07
Si tu veux je te fais un résumé ca me fera réviser.. Enfin je vais te dire ce que jai compris on pourras me corriger si besoin
En fait le principe du Western Blot c'est l'identification spécifique. En gros une fois que tu as fait migrer tes protéines qui sont prisonnieres du gel de polyacrylamide tu aimerais l' identifier de manière plus spécifique.
Donc tu vas utiliser le principe de l'antigénicité. Sachant qu'un anticorps est très spécifique des épitopes (qui sont les parties de la protéine reconnues par les Anticorps), on est capable maintenant de rendre certains groupements immunogènes, et notamment les groupements phosphates présents sur les sérines / thréonines / tyrosines (qui seront à la bases de grandes chaines métaboliques).
Cependant les protéines prisonieres du PAG ne sont pas accessibles aux AC. Du coup on applique un champ electrique perpendiculaire au champ électrique initial afin de faire migrer les proteines vers la gauche ou droite pour les faire sortir du PAG, vers une plaque de téflon qui va établir des liaisons hydrophobes avec la protéines, du coup elles seront accessibles aux anticorps. (c'est la plaque du Western blot)
Pour voir maintenant qu'un anticorps s'est bien lié avec l'épitope de la protéine, on va le coupler à un second anticorps en rendant immunogène son fragment constant Fc (dans le cours il a pris l'exemple d'un AC sous la forme d'un Y, le Fc serait la "queue" du Y). Et ce second anticorps sera lui couplé à une molécule fluorescente (c'est en fait une technique d'immuno indirecte).
En gros on couple le Western blot apres avoir fait un SDS PAGE (polyacrylamide gel electrophorese) afin de pouvoir mieux cibler la proteine d'intérêt (un peu comme le bleu de coomassie qui permet la fixation spécifiquement sur les parties aromatiques).
C'est ce que j'ai compris de ce matin. Si des gens ont des corrections à apporter c'est open !
Tuteur de Biochimie 2014-2015
Bon courage pr la ronéo avec ces nouvelles notions :p